Cryobiology og anhydrobiology af celler

Link: http://newt.phys.unsw.edu.au/~jw/cryoblurb.html

Indledning studiet af skader, der produceres af indefrysning og/eller lave temperaturer og lavt vand-indholdet er vigtigt i en række felter, som her er nogle eksempler: I medicin, kirurger vil gerne være i stand til at cryopreserve organer til transplantationer. Til dato, men den kryopræservering af store organer (undtagen blodet) har en dårlig succesrate. Blod og sex-celler er rutinemæssigt frosset og optøet til senere brug, men selv da, i mange tilfælde, den cellulære survival priser er uacceptabelt lav. Kryopræservering er også vigtigt at fastholde germplasm for vigtigt eller truede arter. Frostskader er en vigtig agronomiske bekymring: hvis landmændene kan få en afgrøde i jorden, før den sidste frost, så de har en længere vækstsæson og en større udbytte. Skader i frø under tørring og rehydrering kan også være agronomisk og økologisk vigtige. Tørring og frysetørring er også vigtigt i fødevareindustrien.

Frysning er værre end kulde

kulde og egentlig ikke så slemt, når vi får over nogle homeothermic fordomme. Homeotherms (varm blooded dyr som os) kan blive alvorligt beskadiget, hvis vores kerne temperatur falder endnu flere grader i en længere periode. Men dette er sjældne i dyrenes verden, og næsten ukendt i anlægget verden: de fleste dyr og næsten alle planter er poikilotherms – deres temperatur er ikke meget forskellig fra omgivelser, så de overlever den miljømæssige temperatur variationer. Med nogle undtagelser (parasitter af homeotherms, grotte beboere etc.), miljømæssige temperaturer kan variere betydeligt. Nogle af de store dyr, der kan reducere temperaturen variation ved at flytte, af sved, af stofskifte osv., og nogle store planter styre deres temperaturer ved at kontrollere stråling udveksling, metabolisme, og udskillelse. Men det overvældende flertal af de nulevende arter kan overleve ændringer i temperaturen af et tocifret °C – mange overleve frysning. Små serier af hydrering er overlevet ved de fleste organismer. Mange planter og lavere dyr (især frø og sporer) kan overleve udtørring i luften, men de fleste kan ikke.

Yderligere, kryogene temperaturer (dem nær kogepunktet af nitrogen (kvælstof) er ikke farlige per se. Ved flydende kvælstof temperaturer, næsten alle biokemi og fysiologi er så langsom, at intet (herunder skade!) der sker i disse temperaturer. Køling til kryogene temperaturer kan dræbe, og varmer op, kan dræbe—vi vil diskutere disse senere—men lidt skader opstår i kryopræserverede stat.

Frysning, men er ofte dødelig. På omfanget af organer, dannelsen af is kan forårsage mekaniske skader ved ekspansion, eller brud, som påpeget iskrystaller vokser gennem væv. Yderligere, hvis isen dannes inde i den celle, celle næsten altid dør. Der har været et par af de seneste rapporter af celler overlevende intracellulære isdannelse (IIF) in vitro – , men IIF er normalt tages ved at arbejde cryobiologists som angiver celledød.

Ice er en dårlig opløsningsmiddel. Når isen dannes i en vandig opløsning, de fleste opløste stoffer er udelukket fra isen, og forblive i en koncentreret optøede løsning. Så koncentrationen bliver meget stort, og kan være giftige. Høje koncentrationer af salte, der påvirker det elektriske eller ioniske interaktioner, herunder dem, der hjælper til at stabilisere den oprindelige tilstand af enzymer. Den udfolder sig og denaturering af enzymer er ofte uoprettelige. Yderligere, is og vand interagerer forskelligt med overflader af membraner og makromolekyler, som er vigtige, fordi disse interaktioner (via overfladespændingen af vand eller den hydrofobe effekt) er også involveret i at bevare den sunde tilstand af cellens indre anatomi eller ultrastructure.
Før vi går videre til at se på frysepunktet skader, overveje spørgsmålet: Hvordan man undgår intracellulære isdannelse? Det kan blive spurgt, og svarede på de fysiologiske, økologiske og medicinsk niveauer. at Holde sig varm er den enkleste svar, selv om denne strategi ikke er tilgængelig til mange levende ting i de fleste miljøer. Fire andre strategier er underafkøling, frysepunktssænkning, dehydrering og forglasning,. Disse forekommer i varierende omfang i både den kunstige processen med at nedfryse og miljømæssige frysning. I alle tilfælde, integriteten af cellens plasma-membran, der er afgørende. En intakt membran, der er nødvendige for at forhindre ekstracellulære is fra nucleating intracellulære is. Men en intakt membran, der er afgørende for, andre grunde for (fx opretholdelse af de forskellige sammensætninger af intra – og ekstracellulære løsninger) og ruptur af membranen er også meget brugt som en indikator for celledød.

 

Undgå intracellulære isdannelse

SupercoolingSupercooling henviser til at tage en væske under sin ligevægt frysepunktet, uden at fryse. Biologiske løsninger i stedet for kan normalt supercool et par °C eller mere. Fra det synspunkt af den organisme, denne fastfrysning undgåelse mekanisme har den fordel, at de løsninger, der forbliver flydende, og giver en forholdsvis normal, men langsommere stofskifte. Det har den ulempe, at en underafkølede løsning er ustabil: hvis en iskrystal er indført, at det har en tendens til at fryse straks, at danne is og en mere koncentreret opløsning. En meget lille mængde af en ren løsning kan supercool så meget ti °C, men den biologiske løsninger, der er truet af is nucleators, der kan tage initiativ til frysning enten inden for eller uden for cellen. Underafkøling er en afgørende strategi for nogle Antarktiske fisk, der lever i en løsning med en højere koncentration og større frysepunktssænkning end dem af deres egne væv. Deres blod bærer en potent protein “frostvæske”. Dette stof findes kun i lille molære koncentrationer, ikke trykke ligevægt frysepunktet, men virker ved at hæmme vækst af iskrystaller (DeVries, 1984). De miljømæssige temperatur for disse fisk har en robust nedre grænse: de vil ikke støde temperaturer koldere end frysepunkt på havet. Uden en sådan nedre grænse, underafkøling strategi er en farlig en. Bladene ofte supercool et par grader, og kan dermed overleve mild frost uden at fryse skader, der henviser til, at lidt koldere temperaturer kan forårsage omfattende skader (Lutze et al., 1998). Betydningen af underafkøling i kryopræservering er, at det giver mulighed for forglasning, som vi ser på senere. Frysepunktssænkning Mange planter og dyr, som er fundet i kolde miljøer akkumulere opløselige molekyler (opløste stoffer) i deres intracellulære og ofte ekstracellulære løsninger (Leopold, 1986, Lee, 1989, Koster og Lynch, 1992). Disse opløste stoffer lavere ligevægt frysepunktet. Et andet resultat er, at organismen er mere modstandsdygtig over for udtørring, for osmotiske grunde diskuteret nedenfor. Frysepunktssænkning af mere end et par °C kræver temmelig meget koncentreret løsninger (se konvertering diagrammet nedenfor). Der er store stigninger i koncentration af salte, der er sjældne i biologiske systemer til elektrisk grunde, der er nævnt ovenfor. Opløste stoffer, som kan tolereres i høje koncentrationer (kompatible opløsninger) omfatter en række af sukker. Høje koncentrationer af sådanne molekyler øge viskositeten og dermed mindske udbredelsen i løsninger. Dette sænker stofskiftet, men har fordele for en endnu langsommere dehydrering og for forglasning, som vi diskutere senere. Den vigtigste betydning af frysepunktssænkning i kryopræservering er i undgåelse af krystallisation i høj temperatur, lav viskositet regime. Dehydrering Frysning sker normalt uden for cellen, for det første, fordi det er, hvor der er mere frysning kerner, og fordi de ekstra-cellulære løsning har en større volumen, end den intracellulære løsning. Når dette sker, ekstra-cellulære opløste stoffer er koncentreret i en lille mængde af frosne vand, der nødvendigvis har en højere osmotisk tryk. Dette får vand til at forlade cellen. Den karakteristiske tid for vandet at strømme ud af cellerne under disse betingelser er ti sekunder (Wolfe og Bryant, 1992), så henviser vi til køling hurtigt eller langsomt, alt efter om betydelige ændringer i temperatur er muligt i dette tidsrum. Kryopræservering normalt bruger hurtig afkøling og så, når og hvis ekstracellulære is opstår, vil cellerne ikke har tid til at dehydrere alvorligt, selvom der er normalt en vis udtørring af cryobiological betydning. Miljømæssige køling, på den anden side er langsom, så vand er som regel tæt på at være i balance, undtagen under ekstreme dehydrering.

 Figur: En meget forenklet skitse viser en celle før og efter frysning af dens væv eller støtte medium. Den forhøjede osmotisk tryk medfører en stor reduktion i den vandige volumen af cellen. Derfor, alle de ikke-vandige komponenter, der er bragt i umiddelbar nærhed. I denne tilstand, stakke af membraner begynder at ligne lamellar faser.

Mange arter af planter og dyr, og især deres frø og sporer, der kan overleve ved temperaturer under frysepunktet cellulære dehydrering. Dehydrering øger det osmotiske tryk af den intracellulære løsning (cytoplasma), som hæmmer dets frysepunkt og fremmer forglasning—både hæmme intracellulære isdannelse. Ligevægt med is på omkring -20 °C eller med en atmosfære af omkring 80% relativ fugtighed kræver, at et trådløst interiør har en sammensætning af omkring 10 osmolal. Osmolal betyder groft ‘osmotically effektiv mol opløst stof pr kg vand’. Mængden af dehydrering for at opnå dette, afhænger af den oprindelige sammensætning. Hvis alle de opløste stoffer var ideelle, og, hvis den oprindelige sammensætning var 1 osmolal (en typisk værdi for en plante celle, og et par gange højere end i de fleste animalske celler), da kun 10% af den oprindelige intracellulære vand, vil forblive. Hvis den oprindelige sammensætning var 2 osmolal, derefter 20% vil forblive. I praksis er disse vand indholdet er undervurderet, fordi den osmotiske tryk af mange løsninger stiger mere end lineært med koncentrationen, og på grund af kolligative egenskaber for det trådløse ultrastructure. Dehydrering i sig selv kan forårsage skader, som vi diskuterer senere i nogle detaljer. Den næste figur viser forholdet mellem flere variabler, som afhænger af det kemiske potentiale i vand, som er en funktion af indefrysning temperatur eller luftfugtighed.

Figur: Denne figur giver mulighed for konvertering mellem flere variabler, der er relateret til vandige opløsninger. Den første skala, der viser, om en log-skala, reduktion i det kemiske potentiale med hensyn til rent vand ved atmosfærisk tryk. Dividere dette med den molekylære mængden af flydende vand giver det de dimensioner af pres. I den udstrækning, at vand er inkompressible, denne mængde er lig med den osmotiske tryk (P) minus det hydrostatiske tryk (S). Den negative af denne mængde kaldes vand potentielle (Slayter, 1967). Den anden skala viser ligevægt frysepunkt på en løsning, hvis vand potentiale er givet i den første skala. Den næste skala, der viser sammensætningen (i osmolal) en løsning, der ville producere en osmotisk tryk, er givet ved den første skala. Skalaen nederst viser den relative fugtighed i en atmosfære bringes i ligevægt med vand under vandet potentielle givet i den første skala, eller med is på en temperatur, der er givet ved den anden. Intracellulære forglasning I kryopræservering, de sædvanlige mål er at opnå intracellulære vitrifikation og samtidig undgå intracellulære isdannelse og membran skade. En af de afgørende faktorer er køling sats. Hvis en væske køles tilstrækkeligt hurtigt, kan det undgå nedfrysning og forglasse (form, en amorf, glas fase). Den nødvendige køling priser er ekstremt høje for rene væsker (fx 10 millioner grader per sekund for rent vand), men langt mere realistiske løsninger. For vandige opløsninger af typiske kryobeskyttelsesmidler, køling priser på 0,1-10 °C/s (groft 10-1,000 °C/min) er tilstrækkelig til at opnå forglasning.

Molekylerne i en væske gennemgå tilfældige, Brownsk bevægelse. For indefrysning at forekomme i en underafkølet væske, den spreder molekyler skal spontant danne en lille klynge (kaldet en kerne eller foster) af molekyler, der midlertidigt har en struktur, der svarer til is. I en underafkølet væske sådanne klynger form og spreder sig hurtigt. Men hvis klyngen er større end en vis kritisk størrelse, det bliver energisk gunstige for andre spreder molekyler til at slutte sig til den struktur, og det vokser gennem prøven (krystallisering, eller frysning). Denne proces kaldes nukleering og crystal vækst. Nukleær kan enten være homogen (som beskrevet ovenfor, og i figuren nedenfor) eller heterogene, hvor en urenhed (eller beholderens væg) udgør et substrat, hvorpå kerner kan vokse.

 Figur: En forenklet skitse af virkningerne af opløste stoffer på nuklear af frost. Vandmolekyler og opløste stoffer er repræsenteret ved symboler, w og s hhv. Pilene repræsenterer diffusion, og længden af pilene angiver hastigheden af diffusion. Den store cirkler repræsenterer den kritiske nukleær radius. I a), blot der er vand til stede. For en kritisk kernen til form, vandmolekylerne i det volumen, der er repræsenteret af den cirkel, skal der spontant arrangerer sig selv i en almindelig is-lignende struktur. Hvis dette regelmæssigt gitter er større end den kritiske størrelse, så de crystal vil vokse. (b) viser situationen i overværelse af opløste stoffer (opløst stof:vand molær ratio er 1:4). For det første, opløste stoffer øge viskositeten, så diffusion er reduceret (og dermed mindre pilene i (b) end (a)). For det andet, for at danne en kritisk kerne, en mængde svarende til eller større end den kritiske radius skal være helt fri af opløst stof molekyler. Dette er ikke tilfældet her. Koncentrationen af opløste stoffer øger denne effekt bliver stærkere, yderligere at reducere risikoen for nuklear.

Sandsynligheden for nuklear i en underafkølet væske, afhænger af flere faktorer: den stiger med omfanget af prøven, og den grad af underafkøling; det falder med stigende løsning koncentration; og det er også stigninger i forekomsten af urenheder, der kan fungere som heterogene kerner. En ren flydende i en lille mængde uden urenheder, der kan være underafkølede en lang vej under sin ligevægt frysepunktet. Små mængder (μl) af rent vand, for eksempel, kan være afkølet til omkring -40 °C.

Ved meget lave temperaturer, viskositeten af en løsning, stiger kraftigt, og molekylær diffusion er reduceret. Hvis afkølingen er hurtig, så er viskositeten stiger hurtigt, hindrer nukleær. Hvis afkølingen er tilstrækkelig hurtigt, viskositet, kan blive så stort, at molekylær diffusion er effektivt standset, og sandsynligheden for kerner dannelsen bliver ubetydelig. Prøven er derefter siges at være en glas eller keramisk solid, og processen kaldes forglasning. Et glas er amorfe (i modsætning til en krystal, har det ikke nogen lang række rækkefølge), men har de mekaniske egenskaber af faste stoffer. Et materiale, der siges at være en glas, hvis dens viskositet når 1014 Pa.s (Franks, 1982). Et glas er per definition i en tilstand af meget lange levetid ikke – ligevægt. Hurtig køling og opvarmning Så, hvordan man kan få celler forbi de farer, der venter dem i frysning og opvarmning? Den næste figur viser, hvordan i tilfælde af hurtig afkøling og opvarmning—altså i kunstig kryopræservering. I dette tilfælde, graden af osmotisk sammentrækning er som regel små, som diskuteret ovenfor. Osmotisk sammentrækning afhænger af køling sats (Mazur, 1963), som er delvis ansvarlig for, at der er en optimal køling sats. Ved meget langsom afkøling priser, omfattende osmotisk sammentrækning sker, og det kan være dødelig i sig selv (drøftes senere). Ved meget høje priser, der er lidt osmotisk sammentrækning, så det opløste stof koncentration i cytoplasmaet er fortsat lav. Dette gør forglasning mindre sandsynligt, og intracellulære frysning mere sandsynligt. Ved moderate priser (værdi afhænger af osmotisk ligevægt tid af cellen og tilbøjelighed til sin cytoplasma til samme is), nogle ikke-dødelige sammentrækning, som får koncentrationen til at stige tilstrækkeligt til, at forglasning kan forekomme. En moderat osmotisk sammentrækning kan kontrolleres med andre midler end køling sats: den ene metode er at køle cellerne til en relativt høj frysepunktet og give dem mulighed for at kontrakten til ligevægt forud for hurtig afkøling. En anden er at tilføje en ikke-penetrerende kryoprotektant, dvs. en ekstracellulær opløst stof, der øger den ekstracellulære osmotisk tryk. Hydroxyethyl stivelse (HES) eller dextran er brugt. Dette har to konsekvenser: den moderat indgået celler undgå IIF i den indledende køling, og den ekstracellulære løsning vitrifies ved relativt høje temperaturer. De detaljerede mekanismer af polymer cryoprotection er stadig uklart (fx Bryant et al., 94).

 Figur: En forenklet og ufuldstændige flow chart til kryopræservering, der viser nogle af de skridt, og nogle af de farer, der er. De sorte rektangler repræsenterer celledød. Der ikke er vist på dette diagram, er muligheden for at forglasning af små mængder i mangel af kryobeskyttelsesmidler, bruger ekstremt hurtig nedkøling.

Cytoplasmaet har en højere opløst koncentration, på grund af en kombination af dehydrering og tilsætning af kryobeskyttelsesmidler, der kan trænge gennem membranen. Dette, sammen med den hurtige afkøling sats, kan sammen give forglasning, som diskuteret ovenfor. Højere køling priser tillade, at lavere doser af det giftige kryobeskyttelsesmidler, men afkøling priser er ofte begrænset i praksis ved varmeledning i de prøver, der skal nedkøles, især for makroskopiske organer.

Når cellen er forglasset, “suspenderet animation” er næsten nået: at alle processer i stofskifte og personskader er faldet til næsten nul. Forudsat at prøve undgår mekanisk chok (briller er skør!), den næste trussel, det står over for, er krystallisation under opvarmning. Den glasagtige tilstand er ustabil med hensyn til ice plus koncentreret opløsning, men det er forhindret i at opnå den stabile tilstand ved sin meget høje viskositet. Efterhånden som temperaturen stiger, viskositeten falder, molekylær bevægelse bliver mindre langsom, og vandmolekylerne kan diffuse og roter i de konfigurationer, der kræves til samme is, eller at tilføje til eksisterende kerner. Chancen for large scale is nukleering og/eller vækst, der forekommer, afhænger af den tid, den prøve, der er udsat for lavere viscosities, mens det er under ligevægt frysepunktet. Således vellykket opvarmning skal krydse dette temperaturområde hurtigt (Rall et al., 1984). Som det er tilfældet med køling, opvarmning priser er normalt begrænset af ledning. Mikrobølgeovn varme har været foreslået, men hurtigt skiftende absorptionsspektrum gør det mere vanskeligt (Baudot, 1997). Der er det yderligere problem, at en hurtig, men inhomogent varme kan producere farlige mekaniske belastninger i makroskopisk væv. Langsom køling og opvarmning Selv ved solopgang og solnedgang, køling og opvarmning priser i naturen er som regel lav sammenlignet med den karakteristiske tid for osmotisk ligevægt. Som et resultat, ekstracellulær frysning ofte forårsager dehydrering, der nærmer sig hydraulisk balance. En undtagelse opstår, når en intracellulære løsning vitrifies og herefter undergår ingen eller meget lidt yderligere tab af vand. I nogle tilfælde af dehydrering uden forglasning, viskositet, kan der stadig være stor nok til at forhindre eller bremse yderligere dehydrering. Den næste Figur viser et flow-chart for langsom afkøling og opvarmning.

 Figur: En forenklet flowdiagram for fryse-tø-skader i nogle arter, der er i stand til akklimatisering, herunder ophobning af opløst stof. De sorte rektangler repræsenterer celledød. Den nødvendige ligevægt dehydrering kan være betydelige. I en tidligere figur så vi, at der fryser til -10° C kræver osmotisk tryk i mere end 10 MPa og løsninger af flere osmolal. For typiske celler med osmolalities mindre end én, kræver dette en flere-fold reduktion i vandindholdet. Vi er hovedsagelig beskæftiger sig med de fysiske påvirkninger, der produceres af denne frysning-induceret dehydrering, men vi skal kort beskrive to andre skader mekanismer første. Brud under frysning og sammentrækning Under denne proces af frysning og osmotisk sammentrækning, nogle celler brud. Simpel mekanisk brud af den fremrykkende is krystaller er en sandsynlig årsag. En anden årsag til brud kan være elektrisk: den store forbigående elektriske felt, der er forbundet med en fremrykkende is foran i en svag elektrolyt opløsning medfører en potentiel forskel på tværs af de celler, som er stort nok til at briste membraner, og som er korreleret med brud (Steponkus et al., 1985). Irreversible osmotisk sammentrækning Osmotisk sammentrækning er ofte uoprettelige. Celler, der er isoleret fra blade af nogle frost følsomme plante-arter har en begrænset evne til at indgå kontrakter og til at udvide osmotically, og denne er korreleret med forekomsten af frost skader. Planter, som har været akklimatiseret til at lave (men ikke frost) temperaturerne er langt mindre modtagelige over for frost skader på beskedne temperaturer under frysepunktet, og deres protoplasts (isolerede celler) er i stand til meget større osmotisk udflugter (Wiest og Steponkus, 1978). Protoplasts har den egenskab, at de bliver sfærisk, når suspenderet i medierne at have et stort udvalg af osmotisk tryk. Når koncentrationen af suspension medium er steget, (osmotisk tilsvarende af ekstracellulær frysning) protoplasts i første omgang bliver slap, men over flere minutter, de bliver sfærisk med et mindre område. Plasma membranen har en lille hvile-spænding—et par tiendedele af et mN/m. Dette er den proces, der er ikke altid reversible. Når det eksterne medie pludselig fortyndet tilbage til sin oprindelige sammensætning (osmotisk svarer til optøning), volumen stiger hurtigt, og området stiger næsten lige så hurtigt. Plasma membranen kan støtte en spænding på kun flere mN/m uden brud. At erstatte dette, og en typisk radius (10 mikron), Young-Laplace forhold giver omkring 1 kPa som maksimum for det hydrostatiske tryk, der kan støttes. Dette er cirka tusind gange mindre end det osmotiske tryk, der er involveret, og så kan glemmes for sådanne celler (men ikke nødvendigvis for lille robust celler i mindre koncentreret medier, såsom røde blodlegemer). Det følger heraf, at området for den celle, der er bestemt af den strøm af vand ind i cellen. For en halvering af koncentrationen af suspension medium, et område stigning af størrelsesordenen 50% er påkrævet. Området elasticitetsmodul for sådan en membran er omkring 200 mN/m, så det er i stand af et elastisk udvidelse af kun et par procent uden brud. Når membranen strækker sig og sin spænding stiger, membran materiale er indarbejdet i membranen på en sats, der er en stærk funktion af den anvendte spænding (Wolfe og Steponkus, 1983). Den biofysik af dette problem er attraktive i, at alle relevante parametre og funktioner, der kan måles: osmotisk egenskaber ved den løsning, at den hydrauliske ledningsevne af den membran, dens relevante elasticitetsmodul, sats af membran materiale stiftelse og sandsynligheden for brud som funktioner af spænding. Yderligere, differential ligninger for spændinger og sandsynligheden for, at lysis er nødt analytisk, men akavet, løsninger (for detaljer, se Wolfe et al., 1985, 1986, Dowgert et al., 1987). Et resultat er uventet: membraner fra akklimatiseret planter er lidt mindre robust end dem fra ikke-akklimatiseret. Men de mere end kompensere for dette ved at have en meget større andel af indsættelse af nyt materiale. Skader, der produceres af svær dehydrering Frysning skader på frost tolerante planter er korreleret med forskellige cellulære fejl: tab af membran semipermeability i at fryse-induceret dehydreret tilstand. Som irreversibel osmotisk sammentrækning, der er beskrevet ovenfor, kan dette symptom kan gengives af osmotisk manipulation ved stuetemperatur: protoplasts dehydreret i høj koncentration suspension medier dehydrere, men når mediet er fortyndet, de undlader at udvide osmotically. En række af udtørring tolerante arter af planter og dyr, også støtte væsentlig dehydrations men, i nogle tilfælde, dehydrering under en kritisk værdi (for 10% vandindhold) kan være dødelig. I dette tilfælde, frysning skader og udtørring skader, der er ens, og cryobiology og anhydrobiology overlapper hinanden. I begge tilfælde, ophobning af opløste stoffer kan reducere eller forebygge skader model-systemer og arter, som er frysning eller udtørring tolerant er observeret til at akkumulere opløste stoffer, især saccharose og trehalose (Leopold, 1986).
En række symptomer på skader er rapporteret i den alvorligt dehydreret tilstand for både model membran-systemer og membraner i levende celler. (jeg) I de lipider, som er de største molekylære bestanddel af cellemembraner, gel-flydende krystal fase overgangen sker ved højere temperaturer (fx Crowe et al., 1988, Tsvetkov et al., 1989, Koster et al., 1994, og henvisningerne i disse papirer). Dette er vigtigt, fordi eksistensen af de faser, der har været forbundet med nedsat semipermeability. (ii) Membraner kan gennemgå topologiske forandringer. Elektron micrographs vis membraner i forbindelse med arrays af lange cylindre, der ligner omvendte sekskantet fase dannet af nogle lipid-vand-dispersioner til meget lave hydrering. I denne fase, vandet er fundet i lange, smalle flasker på en sekskantet array, hver cylinder omgivet af den hydrofile del af lipider. Denne geometri, der gør dem uegnede til at danne en semipermeabel barriere. Andre topologiske ændringer er også blevet rapporteret (Fujikawa 1995, Gordon-Kamm og Steponkus 1984, Uemura et al., 1995, Webb et al., 1993). (iii) Lateral fase separationer kan forekomme i flydende form. Ved lave hydrations, store områder af protein gratis membran, der er observeret i elektron micrographs. Yderligere, fase separation kan forekomme at producere en fase rig på meget fugtgivende lipid arter, og et andet rige i svagt hydrating arter. Betydningen her er, at den inverterede sekskantet faser, kan de fleste nemt at være dannet af svagt hydrating lipider i mangel af protein. Vi har foreslået en simpel model (Bryant og Wolfe, 1992, Wolfe og Bryant, 1999, 2001), som forklarer ovennævnte fænomener og, så vidt vi er bekendt, er alle relaterede data. Overveje en celle, hvis vandindholdet er blevet reduceret til (lad os sige) 10% i volumen. Lad os antage, at en membran rig del af den celle, der har det samme indhold af vand, og at deres membraner er 5 nm tyk. Membranerne er derfor i gennemsnit 0,5 nm fra hinanden. Ved denne adskillelse, alle hydrofile overflader i vand (herunder membraner) opleve en stærk frastødning kaldet hydrering kraft, der falder omtrent eksponentielt med separation, har en karakteristisk længde på omkring 0,2 nm, og hvis ekstrapolerede værdi på nul frastødning (Po) er typisk 10-100 MPa. Fjernelse af inter-membran vand i denne ordning, enten reducerer tykkelsen af den inter-membran lag, og gør således et stort arbejde mod denne stærke frastødning, eller andet reducerer det område af inter-membran lag og dermed komprimerer membraner i deres fly. I praksis betyder det begge dele.

 Figur: En tegneserie af lipid vand faser af modellen membraner udstiller dehydrering stammerMekanisk ligevægt i den normale retning, kræver det, at suge i den inter-membran fase har samme størrelsesorden som den frastødende kraft. I lateral retning, kræver det, at membraner støtte en trykspænding svarer i størrelsesorden til den inter-membran suge gange inter – membran adskillelse. Svær dehydrering af membran rige regioner forårsager således stakke af membraner, der ligner en lamellar fase, mens komprimere dem sideværts for at gøre dem tykkere i den normale retning. I de områder af cellen rig på makromolekyler, makromolekyler vil også blive skubbet ind i tæt separation og vil lide anisotropisk indre spændinger, som komprimere dem langs deres længere akser, men i dette tilfælde er den geometri, der er mindre enkel (Wolfe og Bryant, 1999). Vi vil koncentrere sig om membraner her. Kolligative egenskaber af membraner og opløste stoffer er sammenlignet i figur nedenfor.

 Figur: Sammenligning af frysepunktet depression på grund af opløste stoffer og membraner. (a) og (c) viser den adfærd af en ideel løsning. I (a) det er vist som ligevægt frysepunktssænkning som en funktion af koncentrationen (for sukker, den eksperimentelle kurven er lavere end den linje, der i høj koncentration). I (c) samme forhold er repræsenteret som den molekylære ratio vand:opløst stof, som funktion af temperaturen. De vandrette linjer viser den simple kendsgerning, at det for en stikprøve med en given komposition, sammensætning er konstant over ligevægt frysepunktet. De kolligative effekter af membraner er normalt beskrevet i forhold til den inter – membran frastødning, og den inter-membran adskillelse. For et stort udvalg af lipid membraner, dette forhold er godt tilnærmes ved en frastødning, der aftager eksponentielt med adskillelse, som vist i (b). At konvertere dette til et plot af vand:lipid forholdet som en funktion af temperatur giver (d). Bemærk den kvalitative lighed med (c). I membranen tilfælde, at vandet:lipid-forhold har en øvre grænse på omkring 30:1 inter-membran energi er et minimum (kraft er nul) og så tilføje yderligere vand til sådan en prøve, der skaber blot en overskydende vand fase (ved temperaturer over frysepunktet), eller mere is (ved temperaturer under frysepunktet). For eksperimentelle data, se Yoon et al. (1998) eller Wolfe og Bryant (1999). Hvor store er disse effekter? Overvej en enkelt komponent lipid membran. Gel-flydende krystal fase overgang indebærer en reduktion i areal per molekyle og en stigning i dens tykkelse. Når disse kvasi to dimensionelle objekter, der er komprimeret i flyet med en lateral stress p, gel fase, som har et lavere område per molekyle, der er begunstiget, og temperaturen af overgangen er derfor forhøjet på grund af den Clausius-Clapeyron effekt. (Dette er den effekt, som i tre dimensioner, får kogepunktet for vand til at afhænge af det atmosfæriske tryk.) Ved hjælp af typiske værdier for dette giver en højde af for 0,5 °C for hver ekstra mN/m, sideværts stress. I en afstand af 0,5 nm og med en frastødning af 20 MPa, de laterale stress er omkring 10 mN/m (der er flere oplysninger i Wolfe og Bryant, 1992; 1999). En spektakulær måde i membraner, som kan reagere på den laterale stress er ved at danne ikke-plane geometrier, herunder den omvendte sekskantede (HII) fase, som vises i en foregående figur. For svagt hydrating arter, denne geometri giver en stor forholdet mellem lipid volumen til mængde vand, men denne overgang ikke kan analyseres med en så simpel model, fordi det indebærer, at energi i forbindelse med den krumning af interface.
I en membran, der består af blandinger af lipider, der på forskellig fase overgang temperaturer, en række af de faser, der er beskrevet ovenfor, kan eksistere side om side (fx gel-flydende sameksistens) over en vifte af temperatur. Dette er analogt til fast og flydende fase sameksistens mellem den smeltende punkter af komponenter af blandinger af tre dimensionelle materialer.

I membraner ved lave hydrering, en anden mekanisme, der kan give anledning til adskillelse i to sameksisterende flydende krystal faser. Mener de tilfælde, hvor to eller flere komponenter, som har meget forskellige hydrering egenskaber (fx forskellige Po) – dvs du har en blanding af en meget fugtgivende arter og et svagt hydrating arter. I dette tilfælde en homogen blanding af komponenter, der har en indre energi, der er noget højere, end de adskilte faser. I mange tilfælde, at denne forskel i den indre energi, der er stort nok til at overvinde entropi demixing, og blandingen vil fase separat. foregående figur. Her fase har en højere koncentration af de meget fugtgivende arter og en højere inter-membran adskillelse end den anden.

Denne effekt blev første forudsiges teoretisk (Bryant og Wolfe, 89), og derefter observeret eksperimentelt ved hjælp af small angle X-ray diffraktion og solid-state NMR (Bryant et al., 1992) for blandinger af POPC og POPE (to blandede kæde umættede fosfolipider, der er typiske for dem, der findes i plantens membraner). I overskydende vand, og de to arter er helt blandbar, der udgør en enkelt gråt fase. Ved 10% indhold af vand og 315 K dog blanding inddeler i to separate lamellar faser med forskellige former for skilsmisser. Dehydrering-induceret væske-væske fase separation er siden blevet observeret for andre systemer (Webb et al. 1993).

Eksistensen af væske-væske fase separation er ikke i sig selv nødvendigvis en fare for, at den biologiske materialer. Dog kunne det være et nødvendigt mellemled i dannelsen af skadelige omvendt faser (såsom HII). Cellemembraner er sammensat primært af stærkt fugtgivende lipider, der har tendens til at danne lamellar faser på alle hydrations. Svagt hydrating arter (som har en tendens til at danne omvendt faser ved lave hydrations) er normalt i mindretal: hvis de ikke var, så bilayer membraner ville ikke være stabil. Selv under svær dehydrations, omvendt faser er usandsynligt, at der forekommer i disse membraner, hvis de forbliver homogen. Men hvis væske-væske fase separation sker, svagt hydrating lipider er koncentreret i lav hydrering væske faser, og er så fri til at gennemgå overgangen til en omvendt fase, hvis hydrering er lav nok. Dermed væske-væske fase separationer kan være en forløber for dannelsen af den omvendte faser, hvilket har været korreleret med membran skade under udtørring og frysning. Effekten af opløste stoffer (kryobeskyttelsesmidler) tilstedeværelsen af høje koncentrationer af lavmolekylære opløste stoffer i model membran-systemer reducerer forekomsten af de virkninger, der er forbundet med dehydrering skader: de reducerer højden af membran overgang temperatur, og de reducerer forekomsten af ikke-lamelagtig faser. Dette kan være en af grundene til, fryse – og udtørring – tilpasset arter har udviklet sig til at akkumulere opløste stoffer, ofte saccharose, trehalose eller andre sukkerarter (f.eks Leopold, 1986, Crowe et al., 1988).

Osmotiske effekter Ved en given kemisk potentiale i vand, tilstedeværelsen af flere opløste stoffer kræver tilstedeværelse af mere vand (det første, se figur ovenfor). En celle eller en vesikel, der har en højere indre koncentration ved temperaturer over frysepunktet, vil kontrakten mindre i ligevægt med is på ethvert givet frysepunktet. Yderligere, tilføjelse af nye opløst stof kræver en reduktion i koncentrationen af andre, der allerede er til stede. Tilstedeværelsen af en høj koncentration af sukker reducerer koncentrationen af ioner, der er nødvendig for at producere en given osmotisk tryk. Så tilstedeværelsen af sukker reducerer det farlige, høje ion koncentrationer, der er nævnt tidligere. Opløste stoffer, som kan akkumuleres i store koncentrationer uden at producere toksiske effekter af deres egen kaldes kompatibel opløste stoffer (Brown, 1976).

Reduktion i mekanisk stress, Forudsat at de opløste stoffer partition i den inter-membran lag, deres tilstedeværelse bidrager osmotically til sænkning af det kemiske potentiale i vand. De større osmotisk sigt, at de mindre suge-og så de lavere stress, der er pålagt membran. Denne effekt kan være betydelig (Yoon et al, 1998; Wolfe og Bryant, 1999).

Den betingelse om partitionering er meget vigtigt: mange opløste stoffer, især polymerer, er udelukket fra inter-membran regioner. Som et resultat, deres osmotiske effekt kan have nogen direkte effekt på reduktion af membranen stress, og det kan endda øge det (Koster et al, 2000). Opløste stoffer, som forbliver uden for cellen eller vesikler model-systemer vil også give noget direkte reduktion til membran stress. Ved temperaturer over frysepunktet, tilsætning af opløst stof i den eksterne løsning, i tilstrækkelig høj koncentration, dehydrere celle eller vesikel tilstrækkeligt til at øge stress. Trænger kryobeskyttelsesmidler (såsom DMSO) partition let i den inter – membran plads. Model-systemer, det er ikke nemt at producere en høj koncentration af ikke-trænger opløste stoffer i den inter-membran plads, så sammenligninger mellem forskellige eksperimenter bør gøres omhyggeligt, medmindre den inter-membran koncentration, snarere end den samlede prøve koncentration, der er målt.

Yoon et al. (1998) undersøgte lipid-opløst stof-vand-systemer ved temperaturer under frysepunktet, og brugt det for nuklear magnetisk resonans-signal af vand til at bestemme fordelingen af opløst stof og solvent mellem lamellar faser og en koncentreret bulk-løsning fase i ligevægt med is (de bruges enten D2O eller deuterated opløste stoffer). For små molekyler opløst stof (DMSO og sorbitol), fandt de, at den fase, adfærd var tæt på det forventede hjælp effekter beskrevet ovenfor, og forudsat, at der ikke er specifikke effekter. De fandt, at disaccharider saccharose og trehalose (som er omkring det dobbelte af volumen af de andre), øget hydrering mindre, end man ville forvente fra deres osmotiske effekter alene. Denne effekt var i overensstemmelse med en model, hvor disse molekyler er blevet udelukket fra et meget tyndt lag vand, der er tættest på lipiderne. Yoon et al. konstateret, at alle de opløste stoffer undersøgt faldt den intra-membran stress, men at disaccharider faldt det mere end de mindre opløste stoffer. Dette er kun en af grundene til, saccharose og trehalose kan opstå så meget som naturlige kryobeskyttelsesmidler, dog. Andre årsager til bekymring, vitrifikation og krystallisation.

I princippet, opløste stoffer kan påvirke membran stress på bestemte måder. Hvis de opløste stoffer, der er bundet til membranen overflade, for eksempel, at man ville forvente en ændring i hydrering kraft. En undersøgelse af inter-membran, der styrker ved hjælp af Overfladen Styrker Apparatet findes ingen specifikke effekter på inter – membran kraft på grund af DMSO, sorbitol eller trehalose, men denne undersøgelse var begrænset til tekniske årsager til koncentrationer på omkring 1 kmol.m– i 3 (Pincet et al., 1994).

Vitrifikation og ultrastructure En vigtig ekstra overvejelse opstår, når og hvis den inter-membran lag vitrifies. Det er blevet konstateret, at under disse betingelser dehydrering – induceret stigning i overgangen temperatur reduceres dramatisk, og overgangen kan temperaturen falder til under det fuldt hydreret værdi To (Koster et al., 1994, Crowe et al., 1998). Overveje en membran på et fast hydrering ved en temperatur på et par grader over sin overgang temperatur Tm. Da temperaturen er sænket til Tm overgangen finder sted, ledsaget af en reduktion i areal per lipid (se foregående figur). Men hvis inter-membran vandig opløsning er glas-overgangen kan ikke finde sted. Forglasset lag er en solid, så er i stand til at støtte en betydelig mekanisk stress. Hvis temperaturen sænkes gennem Tm, glas, vil hindre reduktion i området, der er nødvendige for gel fase til at danne. Som temperaturen sænkes under Tm, glas, vil understøtte en stigende trykspænding i membranen. På et tidspunkt under To, stress vil blive store nok til at overvinde tilstedeværelsen af den spejlblanke matrix, og gelen overgangen vil ske. Under opvarmning, overgangen temperatur vil forblive den samme. Omvendt, hvis den membran, der er i gel fase, når forglasning opstår, overgangen vil temperaturen være højere end den fuldt hydreret overgang temperatur To, både køling og opvarmning (Zhang og Steponkus, 1996).

I praksis måles overgang temperatur i overværelse af et glas i intervallet 10-60°C under fuldt hydreret overgang temperatur To. Koster et al. (2000) har målt de mekaniske egenskaber af en relevant sukker glas, og fandt Young ‘ s modul til at være omkring 20 GPa. Ved hjælp af parametre for DPPC (Guldbrand et al., 1982), og eq. (1), trykspænding genereret, hvis lipid forbliver flydende 20°C under To, er omkring 40 mN/m, hvilket svarer til en belastning på omkring 0,4% i glas. Dette niveau af stamme er nemt dokumenterbare af et fast stof.

Betydningen af denne effekt er klar: hvis løsningen er forglasset, mens lipiderne er på flydende krystal-fase, så overgangen vil temperaturen sænkes drastisk, og membraner forbliver i flydende form. Hertil kommer, at dannelsen af glas er to andre vigtige effekter. For det første, hvis løsning vitrifies derefter yderligere dehydrering vil være yderst begrænset, og for det andet, hvis prøven er forglasset, opløst krystallisation vil være begrænset. Dette er til gavn, da den beskyttende virkning af opløste stoffer, der er nævnt i de foregående afsnit, kan kun opstå, hvis den opløste stoffer forbliver i opløsning. Henvisninger og links

  • Baudot, A., 1997, Kryopræservering d’organes par forglasning: mesures calorimétriques et mesures diélectriques, Ph.d. – afhandling, Institut National Polytechnique de Grenoble.
  • Brun, A. D., 1976, Mikrobiel vand stress. Bacteriol. Rev. vol. 40: p. 803-846.
  • Bryant, G. Perez, E., Sputtek, A., 1994, påvirkning af hydroxyethyl stivelse på fosfolipid-monolayer isotermerne. Cryo-Breve, bd. 15: p. 299 – 308.
  • Bryant, G., Pave, J. M., Hasler, J., 1992, Lave hydrering fase egenskaber af fosfolipid-blandinger: beviser for dehydrering-induceret væske-væske separation. Eur Biophys J., vol. 21: p. 223-232. Bryant, G., Wolfe, J., 1992, “Interfacial kræfter i cryobiology og anhydrobiology” Cryo-Breve, bd. 13: p. 23-36.
  • Bryant, G., Wolfe, J., 1989, Kan fugt styrker fremkalde lateral faseadskillelse i membraner? Eur. Biophys. J., vol. 16: p. 369-374.
  • Crowe, J. H., Tømrer, J. F. og Crowe, L. M., 1998, rolle forglasning i anhydrobiosis. Ann. Rev. Physiol. vol. 60, s. 73-103.
  • Crowe, J. H., Crowe, L. M., Tømrer, J. F., Rudolph, A. S., Wistrom, C. A., Spargo, B. J., Anchordoguy, T. J., 1988, Interaktioner af sukker med membraner. Biochim. Biophys. Acta, vol. 947, s. 367-384.
  • DeVries, A. L., 1984, Rolle glycopeptiderne og peptider i hæmning af krystallisering af vandet i de polare fisk, Trans. R. Soc. Lond. vol. B304: p. 575-588.
  • Dowgert, M. F., Wolfe, J., Steponkus, P. L., 1987, mekanik skade isoleret protoplasts følgende osmotisk sammentrækning og udvidelse. Anlægget Physiol. vol. 83: p. 1001-1007.
  • Frankerne, F., 1982, egenskaberne af vandige opløsninger ved temperaturer under frysepunktet, I: Frankerne, F., (Ed). Vand: En omfattende afhandling, vol. 7, Plenum Press, N.Y.
  • Fujikawa, S., 1995, En fryse-fraktur undersøgelse til formål at klarlægge de mekanismer, der er på frysepunktet skade på grund af indefrysning-induceret tætte apposition af membraner i kortikale parenkym celler af mulberry. Cryobiology, vol. 32: p. 444-454.
  • Gordon-Kamm, W. J. Steponkus, P. L., 1984, Lamelagtig-til-sekskantet II fase-overgange i plasma membranen af isolerede protoplasts efter fryse-induceret dehydrering. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 81: p. 6373 – 7.
  • Guldbrand L., Mortensen, B., Wennerstrom, H., 1982, Hydrering styrker og fase ravnoteže i dipalmitoyl phosphatidylcholin-vand-system. J. Coll. Int. Sci., vol. 89: p. 532-541.
  • Koster, K. L., Lei, J. P., Andersen, M., Martin, S. og Bryant, G. (2000) Effekter af forglasset og ikke-forglasset sukker på phosphatidylcholin væske-til – gel fase-overgange. Biophysical Journal 78, 1932-1946.
  • Koster, K. L., Lynch, D. V., 1992, Opløst ophobning og compartmentation under den kolde akklimatisering af Puma rug. Anlægget Physiol., vol. 98: p. 108-113.
  • Koster K. L., Webb, M. S., Bryant, G., Lynch, D. V., 1994, Interaktioner mellem opløselige sukkerarter og POPC (1palmitoyl-2-oleoyl – phosphatidylcholin) under dehydrering: forglasning af sukker ændrer fase adfærd phospholipid. Biochim. Biophys. Acta, vol. 1193: p. 143-150.
  • Lee, R., 1989, Insekt-kolde-hårdførhed: At fryse eller ikke at fryse, Bioscience, vol. 39: p. 308-313.
  • Leopold, A. C., (Red), 1986, Membraner, Stofskifte og Tør Organismer, Cornell Univ. Tryk på,, NY.
  • Lutze, J. L., Roden, J. S., Holly, JC.J., Wolfe, J., Egerton, J. J. G., Bold, M. C., 1998, Forhøjet atmosfærisk [CO2] fremmer frostskader i stedsegrønt træ, planter, Plante -, Celle-og Miljø, vol. 21: p. 631-635.
  • Mazur, P., 1963, Kinetik af vandtab fra celler ved temperaturer under frysepunktet og sandsynligheden for, at intracellulære frost, J. Generelt Physiol., vol., 47: p. 347-369.
  • Pincet, F., Perez, E., Wolfe, J., 1994, Gøre trehalose og dimethylsulphoxide påvirke inter-membran, der styrker? Cryobiology, vol. 31: p. 531-539.
  • Rall, W. F., Reid, D. S., Polge, C., 1984, Analyse af langsom opvarmning skade af musen embryoner af cryomicroscopical og fysisk-kemiske metoder, Cryobiology, vol. 21: p. 106-121.
  • Slatyer, R., 1967, Plante-vand relationer, Akademisk, N.Y.
  • Steponkus, P. L., Stout, D. G., Wolfe, J. Lovelace, R. V. E., 1985, Mulige rolle forbigående elektriske felter, i frost-induceret membran destabilisering. J. Po. Biol., vol. 85: p. 191-198.
  • Tsvetkov, T. D., Tsonev, L. I., Tsvetkova, N. M., Koynova, R. D., Tenchov, B. G., 1989, Effekt af Trehalose på Fase Egenskaber hydreret frysetørrede Dipalmitoylphosphatidylcholine multilagsbelægning bestående. Cryobiology, vol. 26: p. 162-169.
  • Uemura, M., Joseph, R. A.,Steponkus, P. L., 1995. Kolde akklimatisering af Arabidopsis thaliana. Anlægget Physiol., vol. 109: p. 15-30.
  • Webb, M. S., Hui, S. K., Steponkus, P. L., 1993, Dehydrering-induceret lamellar-til-sekskantede-II fase-overgange i DOPE/DOPC blandinger. Biochim. Biophys. Acta, vol., 1145: p. 93-104.
  • Wiest, S. C., Steponkus, P. L., 1978, Fryse-tø-skade isoleret spinat protoplasts og simulering på over frysepunktet. Anlægget Physiol., vol. 62: p. 699-705.
  • Wolfe, J., Bryant, G., 1992, Fysiske principper for membran skade på grund af udtørring og frysning. i Mekanik af hævelse: fra ler til levende celler og væv, T. K. Karalis (ed.), NATO ASI-Serien H, vol. 64: p. 205-224.
  • Wolfe, J. Bryant, G., 1999. Frysning, tørring og/eller forglasning af membran-opløst stof-vand-systemer. Cryobiology, 39, 103-129.
  • Wolfe, J. og Bryant, G. 2001, “Cellular cryobiology: termiske og mekaniske effekter” International Journal of Refrigeration, 24, 438-450.
  • Wolfe, J., Steponkus, P. L., 1983, Mekaniske egenskaber af plasma membranen af isolerede anlæg protoplasts. Pl. Phys., vol. 71: p. 276-285.
  • Wolfe, J., Dowgert, M. F., Steponkus, P. L., 1985, Dynamik indbygning af materiale til plasma membranen og lysis af protoplasts under hurtig ekspansion i området. J. Po. Biol., vol. 86: p. 127 – 138.
  • Wolfe, J., Dowgert, M. F., Steponkus, P. L., 1986, Mekanisk undersøgelse af deformationer og brud i plasma-membraner af protoplasts under osmotisk udvidelser. J. Po. Biol., vol. 93: p. 63-74.
  • Håndværker, E. J., Reynolds, S.E., 1950, Elektriske fænomener, der opstår under indefrysning af fortyndede opløsninger og deres mulige forhold til tordenvejr elektricitet. Phys. Rev., vol. 78: p. 254-259.
  • Yan, Z., Pave, J., Wolfe, J., 1993, kernemagnetisk resonans spektroskopi af frosne phosphatidylcholin-D2O ophæng: en ny teknik til måling af fugt styrker. J. Chem. Soc. Faraday Trans., vol. 89: p. 2583-2588.
  • Yoon, Y. H., Pave, J. og Wolfe, J. (1998) “virkningerne af opløste stoffer på indefrysning egenskaber og hydrering kræfter i lipid-lamelagtig faserBiophys. J.: 74, 1949-1965.